发布日期：2024-12-26 04:08 点击次数：134
玉米从请示到老练经过中会发生多样虫害，如亚洲玉米螟、黏虫等地上害虫和地老虎、玉米根叶甲等地下害虫。在我国，亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）是对玉米最具有碎裂性的鳞翅目虫豸之一[1]，对玉米系数生养期均会形成严重影响。玉米螟幼虫在玉米心叶期取食玉米叶肉或蛀食未展欢乐叶，抽雄后钻蛀茎秆，取食籽粒，使雌穗发育受阻而减产，遇大风则易由虫孔处撅断淫淫网官网，且在籽粒上的伤口成为玉米镰孢菌侵染的部位，激发或加剧镰孢穗腐病的发生。棉铃虫（Helicoverpa armigera）笔名玉米穗虫，以幼虫取食玉米叶片成孔洞或缺刻，并危害茎、雌穗，不仅使玉米减产，况兼能诱发玉米穗腐病的发生[2-5]。黏虫（Mythimna separata）因其群聚性、迁飞性、杂食性、暴食性，成为宇宙性垂危农业害虫[6]，近几年黏虫大爆发带来的玉米减产遏止冷落。害虫在咬食玉米嫩粒后，可形成籽粒缺损、霉粒、玉米品性裁汰。由于玉米霉变屡次形成衍生场禽畜的群体发病，严重影响衍生业的分娩，永久饲喂含有霉变的玉米，不仅危害动物，且残留在动物体内的无益物资会给东谈主类健康带来隐患。
传统防治害虫的要领主若是施用化学农药，但多数施用化学农药，浑浊环境，误杀成心虫豸，碎裂生态均衡，同期易形成东谈主畜中毒。连年来，转基因植物的发展关于害虫的防治探索了一条新的阶梯[7]。海外转Bt基因抗虫玉米的推敲起步较早[8]，1996年转基因抗虫玉米照旧驱动营业化请示[9]。而国内抗虫转基因玉米的推敲较海外晚，尚未获准营业化分娩。Bt cry1Ah基因是从国内筛选的Bt菌株中决然克隆的新式Bt基因，具有自主学问产权[10]。Cry1Ah卵白对鳞翅目害虫的毒力强于Cry1Ab和Cry1Ac卵白[11]。已有推敲标明，外源基因通过密码子优化可权贵普及基因在植物中的抒发水平[12]。将Bt cry1Ah基因应用不同的密码子优化模式和鼎新要领鼎新玉米，得到了抗虫的转基因玉米[13-15]。本推敲通过农杆菌介导法将cry1Ah基因转入玉米自交系综31中，通过群体筛选，得到了对亚洲玉米螟有权贵抗性的转基因植株HGK60。为了决然HGK60事件的抗虫恶果，在田间和室内用HGK60转基因玉米辩别饲喂亚洲玉米螟、棉铃虫和黏虫幼虫，不雅察幼虫取食情况，评价HGK60玉米的抗虫恶果及应用后劲，以期为培育新式的抗虫玉米提供种质资源，用于玉米抗虫育种。
1 材料与要领 1.1 材料 1.1.1 植物材料玉米自交系综31（受体材料）及T3代转Bt cry1Ah基因抗虫玉米材料HGK60由本实验室保存。
1.1.2 供试虫源亚洲玉米螟由中国农业科学院植物保护推敲所何康来推敲员提供。棉铃虫由中国农业科学院植物保护推敲所梁革梅推敲员提供。玉米黏虫由中国农业科学院植物保护推敲所黏虫组提供。
1.2 要领 1.2.1 PCR检测转基因植株取玉米幼苗的叶片用CTAB法索要基因组DNA，选定cry1Ah特异性引物对其进行PCR检测，筛选阳性植株。特异性引物序列为F：5'-GCATCTCCACCTACACCGACTA-3'和R：5'-CGGCTGGAATCTGGGTAATC-3'，扩增居品长度为800 bp，响应条目为：95℃ 2 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，32个轮回；72℃蔓延10 min。
1.2.2 Cry1Ah卵白抒发含量取玉米不同生永劫期（六叶期、抽穗期和灌浆初期）的伸开叶片、心叶、茎、雄穗、花丝、雌穗轴、苞叶等组织，索要卵白，应用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测转基因植株的Cry1Ah卵白抒发量，以纯化的Cry1Ah卵白制作措施弧线。卵白索要及ELISA检测要领均按试剂盒说明书进行，ELISA检测试剂盒购自好意思国Envirologix公司。
1.2.3 玉米螟室表里生测 1.2.3.1 玉米螟室内生测参考王冬妍等[16]要领，从田间汇聚玉米心叶，用羊毫将亚洲玉米螟初孵幼虫接入放有玉米心叶的24孔虫测板中，每24 h拜谒1次幼虫存活数。
色狼1.2.3.2 玉米螟田间生测按照农业部953号公告-10-2007在大田进行随即区组野心。待玉米滋长到7-8叶期时，以每株40-60 头玉米螟初孵幼虫的用量接于心叶中，3 d后类似接虫一次，以非转基因材料为阴性对照，处理要领同转基因材料。玉米吐丝期接虫要领同上，接虫部位是花丝，在接虫2 周后按照公告措施品级判定。
1.2.4 棉铃虫室表里生测 1.2.4.1 棉铃虫室内生测参考芮昌辉等[17]要领，辩别测定玉米叶片、雄穗、苞叶、嫩粒、花丝和玉米芯等器官对棉铃虫1 日龄幼虫的杀虫活性。纪录棉铃虫1日龄幼虫取食HGK60玉米不同器官3 d后的死亡率。
1.2.4.2 棉铃虫田间生测参考农业部953号公告-10-2007进行田间生测并进行品级判定淫淫网官网。
1.2.5 黏虫室表里生测 1.2.5.1 黏虫室内生测参考文件[18， 19]实验要领，取HGK60小喇叭口期的玉米心叶进行室内生测。于12孔虫测板中放入玉米心叶，每孔接1头黏虫初孵幼虫，每个处理类似4次，以非转基因材料为阴性对照。视玉米组织的极新进度，实时更换相似着手的玉米叶片，培养12 d后用精度1/10 000电子分析天平称量幼虫分量。
1.2.5.2 黏虫田间生测参考农业部953号公告-10-2007进行田间生测并进行品级判定。
1.2.6 数据分析应用Excel软件进行数据整理，用SPSS数据处理软件对推行数据进行分析，对不同处理间平均数的相反权贵性比较均经受t考试。
2 完了 2.1 PCR检测遴荐阳性植株对HGK60植株进行PCR检测，以cry1Ah特异性引物检测指标基因，以抒发载体作念阳性对照，以综31作念阴性对照。完了（图 1）知道，含指标基因的转基因植株扩增出的片断大小为800 bp，与阳性对相片断大小一致，综31及阴性植株未扩增出指标片断，1、2、3、5、6、7、10和13有阳性条带，4、8、9、11和12无阳性条带。字据检测完了，留取阳性植株进行更进一步的检测分析。
2.2 Cry1Ah卵白抒发量测定应用ELISA要领检测了HGK60不同期期不同部位的Cry1Ah卵白含量。玉米六叶期属于玉米养分滋长阶段，抽穗期和灌浆初期均属于生殖滋长阶段。如图 2所示，HGK60玉米不同期期不同组织中的Cry1Ah卵白含量存在相反。在养分滋长阶段叶片中的Bt杀虫卵白含量为2 881 ng/g（鲜重，下同），在抽穗期叶片中Cry1Ah卵白的含量达到3 500 ng/g。在灌浆初期的雄穗中Cry1Ah卵白含量最高，为3 977 ng/g。抽雄期的花丝中Cry1Ah卵白含量较低，为657 ng/g，而在灌浆初期花丝中的Cry1Ah卵白含量高潮到1 168 ng/g；穗轴中所含杀虫卵白含量的变化与花丝恰恰相悖，Cry1Ah卵白在抽雄期中高于在灌浆初期中的含量。
2.3 玉米螟室内和室外生物活性检测 2.3.1 玉米螟室内生测室内接虫3 d后，咬食HGK60转基因玉米矫正死亡率如图 3所示。第1天时，咬食转基因玉米心叶的幼虫矫正死亡率接近50%，第3天时玉米螟幼虫沿途死亡。在3次统计中，取食转基因玉米心叶的玉米螟幼虫死亡率权贵高于阴性对照（P＜0.05），标明HGK60转基因玉米对玉米螟幼虫有权贵抗性。由图 3可知，HGK60转基因玉米叶片在接虫3 d后基本莫得受害，且玉米螟咬食的虫孔惟有针头大小，而阴性对照则受害较严重，有较多虫孔。
2.3.2 玉米螟田间生物活性检测由图 4可知，HGK60转基因玉米的叶片在接虫两周后基本无玉米螟危害，惟有一丝针孔大小的虫孔，而阴性对照叶片受害严重，有多个逾越洋火头大小的虫孔，按照判定措施，HGK60田间抗性品级是1.29±0.72级，为高抗级别，相似处理的阴性对照平均抗性品级值为7.06±1.39级，为感虫级别。
玉米吐丝期将玉米螟幼虫接于玉米花丝，HGK60转基因玉米的幼穗受害眇小或者无危害（图 4），按照判定措施抗性级别为1.67±0.72，属高抗级别，而阴性对照幼穗受害较严重，抗性级别为6.34±0.88，属感虫级别，证明HGK60转基因玉米对玉米螟有很强的抗性，此完了与室内抗虫性决然完了一致。
2.4 棉铃虫室内和田间生物活性检测 2.4.1 棉铃虫室内生测以HGK60玉米和阴性对照玉米不同组织喂食棉铃虫，3 d后统计棉铃虫的死亡情况。HGK60玉米对棉铃虫幼虫有很强的鸩杀作用，不同组织因为含有的Cry1Ah卵白量不同，对棉铃虫的致死情况不同，比较棉铃虫1 日龄幼虫取食HGK60玉米不同器官3 d后的死亡率（图 5），初步以为在灌浆初期玉米各部位的杀虫活性规矩为叶片＞苞叶＞雄穗＞籽粒＞穗轴＞花丝。咬食HGK60各部位的幼虫死亡率与阴性对照比拟均有权贵性相反（P＜0.05），标明HGK60对棉铃虫有较好的抗虫性，不错在一定进度上保护植株免受棉铃虫的危害。
2.4.2 棉铃虫田间生物活性检测棉铃虫关于HGK60转基因玉米，雌穗的危害级别为0.97±1.44，而综31雌穗的危害级别为5.4±1.14，对比判定措施可知HGK60转基因玉米雌穗受棉铃虫的危害进度级别平均值在0-1之间，属于高抗型。而阴性对照雌穗受害严重，属于感虫型。图 5所示HGK60玉米雌穗不受棉铃虫危害，而阴性对照植株雌穗上籽粒已被棉铃虫咬食，并有真菌侵入。
2.5 黏虫室内和田间生物活性检测 2.5.1 黏虫室内生测用玉米心叶喂食黏虫初孵幼虫，培养7 d后HGK60和综31饲喂的黏虫幼虫均无死亡情况，而培养12 d后HGK60饲喂的黏虫平均体重为（0.003 5±0.001 4）g，而综31饲喂的黏虫平均体重为（0.044 8±0.009 6）g，P＜0.05，二者之间有权贵相反。如图 6所示，饲喂转基因材料和阴性对照12 d后的黏虫幼虫在长势上有赫然的区别，标明HGK60转基因玉米关于黏虫的毒力莫得对玉米螟的毒力强，然则HGK60转基因玉米对黏虫有赫然的体重扼制。
2.5.2 黏虫田间生物活性检测在接虫14 d后拜谒玉米叶片受黏虫的危害进度，字据其危害进度估量各小区黏虫对玉米叶片危害级别，HGK60的黏虫平均食叶级别为2.47±1.51，综31的黏虫平均食叶级别为6.19±1.56，对比评定措施可知HGK60对黏虫的食叶级别平均值在2.1-4.0之间，属于抗性级别。HGK60玉米叶片基本无黏虫咬食的虫孔或有一丝弹孔大小的虫孔，而阴性对照的叶片有赫然的大片缺刻，严重情况下玉米植株的滋长发育受到影响。
3 参谋玉米螟在玉米幼苗期主要危害心叶，与当今我国批准入口的转基因玉米MON810和Bt11比拟，HGK60六叶期心叶Bt卵白抒发量为1 192 ng/g，虽低于MON810和Bt11的1 880 ng/g和1 473 ng/g，但三者心叶关于亚洲玉米螟的杀虫恶果基本非常，在第3天取食心叶的玉米螟幼虫沿途死亡[16]。有推敲证明，Cry1Ah卵白对鳞翅目害虫的毒力强于Cry1Ab和Cry1Ac卵白，尤其对亚洲玉米螟的杀虫活性约为Cry1Ab的4.6 倍，Cry1Ac的8.2倍[11]，是以即使HGK60心叶的Cry1Ah卵白含量低于MON810和Bt11的Cry1Ab的卵白含量，HGK60对亚洲玉米螟的毒力不弱于MON810和Bt11，HGK60心叶中含有的Bt卵白不错有用防治心叶期玉米螟。玉米螟在抽雄期取食幼嫩的雄穗，HGK60雄穗Bt卵白含量为361 6 ng/g，高于MON810、Bt11中的563 ng/g、215 ng/g，HGK60苞叶中Bt卵白抒发量为1 330 ng/g。在田间生测时，HGK60雄穗莫得出现撅断及被咬食的情况，而大部分综31的雄穗在后期被咬食严重以致撅断。玉米螟还可在雌穗上取食花丝过问里面取食尖端的籽粒和幼嫩的穗轴，也不错通过取食苞叶钻入雌穗里面取食幼嫩籽粒；在灌浆后期钻蛀茎秆为害，茎秆的折损及虫害伤口激发的茎腐病、穗腐病，形成玉米严重减产[20]。在玉米吐丝期进行东谈主工接虫，2周后综31被咬食严重，茎秆处多有蛀孔，伤口处多有霉菌，而HGK60转基因抗虫玉米莫得受到危害。在抽雄期，HGK60雄穗和苞叶中含有的Bt卵白不错有用防治穗期玉米螟。室内生测和田间推行完了均标明，不管叶片如故花丝，HGK60对亚洲玉米螟齐具有相配好的抗性，或者短时辰杀灭玉米螟幼虫，极猛进度减少由于虫害引起的霉变。HGK60事件关于亚洲玉米螟有很好的抗性，与已营业化的转Bt基因抗虫玉米具有相似的杀虫恶果。
棉铃虫食性杂、寄主种类多，连年危害十分豪恣，对玉米的危害也越来越大，转基因玉米的出现权贵裁汰了针对棉铃虫的化学农药的使用量。一代棉铃虫主要在幼苗阶段取食心叶或伸开的幼叶，二代幼虫主要危害刚吐丝的玉米雌穗花丝、雄穗，影响授粉，三代幼虫主要蛀食玉米雌穗籽粒，排出多数虫粪，被害部位被虫粪浑浊产生霉变。HGK60幼苗期和抽雄期时各组织中Bt卵白量不错有用防治鳞翅目害虫。本推行中防备推敲了雌穗部位对棉铃虫幼虫的影响。有推敲标明，MON810雌穗不同组织对棉铃虫的杀虫恶果不同，取食MON810苞叶的棉铃虫初孵幼虫5 d后沿途死亡；取食MON810幼嫩籽粒和穗轴的棉铃虫初孵幼虫5 d的死亡率为90%，即使有一丝存活的幼虫，其发育也受到了严重扼制[6]。本推行推敲完了标明HGK60关于棉铃虫有赫然的杀虫恶果，3 d后取食HGK60各组织的棉铃虫初孵幼虫的死亡率均在95% 以上，或者在短期内快速灭杀棉铃虫幼虫，大田推行完了也知道HGK60玉米对棉铃虫有着很好的杀虫恶果，接棉铃虫2周后的玉米与对照比拟莫得赫然的受害情况，而阴性对照则咬食严重，且被害部位因虫粪浑浊，多出现霉变，对玉米品性形成极大毁伤[21]，这充分说明了HGK60不错有用防治棉铃虫初孵幼虫。
黏虫主要在玉米幼苗期危害玉米叶片，高密度虫量的地区玉米叶片以致被沿途吃光仅剩光杆[22]。以七叶期的MON810和Bt11叶片喂食4日龄黏虫，第8天时，取食MON810和Bt11叶片的幼虫存活率辩别为15%和22.5%[21]，本推行以小喇叭口期HGK60玉米心叶喂食黏虫初孵幼虫，喂食12 d后的完了知道黏虫幼虫莫得出现死亡，然则黏虫幼虫的体重与阴性对照比拟则赫然受到扼制，使得黏虫幼虫的发育受到影响。在黏虫后期滋长经过中，取食阴性植株叶片的黏虫化蛹时辰早于取食HGK60叶片的，化蛹率亦然高于取食HGK60叶片的黏虫，此完了未在文中列出。有推敲报谈，室内取食MON810的1-3日龄黏虫幼虫在第14天时沿途死亡，严重影响黏虫幼虫的滋长发育[6]。HGK60关于黏虫幼虫的体重有扼制作用，关于取食HGK60的幼虫化蛹和成仙情况还需要进一步的推敲。国表里室内和田间推行标明Bt玉米对黏虫的杀虫作用主要进展为影响幼虫存活和严重遏止幼虫滋长发育，这个完了也在本推行推敲中得到说明。HGK60关于黏虫的防治恶果不如对玉米螟的防治恶果赫然，与不同Bt卵白针对的靶标生物不同，如Cry1Ac卵白对棉铃虫毒性较高，比拟较而言关于黏虫的毒性较低[23]。
国表里推敲标明，Bt玉米对玉米螟具有高效的杀虫恶果[24]，对玉米其他鳞翅目害虫如玉米穗虫等也有较好的为止恶果[25]。本推行也证明了Bt玉米关于玉米螟、黏虫、棉铃虫有较好的为止恶果，HGK60转基因玉米不错高效灭杀玉米螟和棉铃虫，不错严重扼制黏虫的滋长发育，这关于多种害虫的共同防治有一定的推敲趣味趣味，害虫发生演替是一个束缚变化的生态学经过，发展害虫详尽处罚对策与本领体系，以便实时开展科学防治，确保Bt作物安全分娩和捏续应用[26-28]。
4 论断应用玉米螟、棉铃虫和黏虫3种鳞翅目害虫对转Bt cry1Ah基因抗虫玉米HGK60事件T3代植株进行室内和田间抗虫性分析，室内及田间生物活性测定完了标明淫淫网官网，HGK60转基因抗虫玉米对玉米螟、棉铃虫有高抗性，对黏虫有抗性。在玉米各发育期，HGK60可有用防治玉米螟、棉铃虫和黏虫等鳞翅目害虫的发生。
